⑫ 染色
免疫組織化学染色：酵素抗体法
免疫染色法は抗原抗体反応を利用して特異的なタンパク質を検出する方法である。
可視化する際に、酵素の活性を利用する染色法を酵素抗体法という。
染色手順
ポリマー法・標識酵素ペルオキシダーゼ
| 1 | 脱パラフィン | キシレン | 3槽、各10分 |
|---|---|---|---|
| 2 | 脱キシレン | 100%エタノール | 3槽、各5分 |
| 3 | 浸水 | 95%、70%エタノール | 各5分 |
| 4 | 流水洗 | 水道水 | |
| 5 | 水洗 | 蒸留水 | |
| 6 | 内因性ペルオキシダーゼ阻止 | 3%過酸化水素水 | 15分 |
| 7 | 流水洗 | 水道水 | |
| 8 | 水洗 | 蒸留水 | |
| 9 | 抗原性賦活化処理 | 0.01Mクエン酸バッファー、 pH6.0 | オートクレーブ、10分、120℃ |
| 10 | 流水洗 | 水道水 | |
| 11 | 水洗 | 蒸留水 | |
| 12 | 洗浄 | PBS | 3回、各5分 |
| 13 | ブロッキング | 10%正常動物血清+0.01%アジ化ナトリウム | 15分〜1時間以上、室温 |
| 14 | 一次抗体 | 一晩、4℃ | |
| 15 | 洗浄 | PBS | 3回、各5分 |
| 16 | 二次抗体 | HRP-ポリマー標識二次抗体 | 室温 |
| 17 | 洗浄 | PBS | 3回、各5分 |
| 18 | 発色 | DAB | およそ1〜15分。顕微鏡で発色を確認する |
| 19 | 流水洗 | 水道水 | |
| 20 | 水洗 | 蒸留水 | |
| 21 | 核染 | ヘマトキシリン染色液 | 1分 |
| 22 | 色出し（流水洗） | 水道水 | 15分 |
| 23 | 脱水 | 70%、95%エタノール | 各5分 |
| 24 | 脱水 | 100%エタノール | 3槽、各5分 |
| 25 | 透徹 | キシレン | 3槽、各10分 |
| 26 | 封入 |
検出方法
抗原抗体反応の検出には、直接法やABC法、LSAB法、ポリマー法など様々な方法がある。
また、それぞれの検出方法に応じて様々な検出キットが各社から販売されている。以下に神経病理解析室で使用しているキットをご紹介する。
① ABC法（Vector Laboratories社 ABC kit）
ビオチン標識二次抗体とアビジン-ビオチン標識酵素を用いる。標識酵素はペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼの三種類。
ABC法のしくみ
- 抗原に一次抗体を反応させる
- 一次抗体にビオチン標識二次抗体を反応させる
- ビオチン標識二次抗体にアビジン-ビオチン標識酵素を反応させる
- 標識酵素の活性を利用して発色基質を発色させる
② LSAB法（ニチレイバイオサイエンス社、SAB-POキット）
ビオチン標識二次抗体とストレプトアビジン標識酵素を用いる。標識酵素はペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼ。
LSAB法のしくみ
- 抗原に一次抗体を反応させる
- 一次抗体にビオチン標識二次抗体を反応させる
- ビオチン標識二次抗体にストレプトアビジン標識酵素を反応させる
- 標識酵素の活性を利用して発色基質を発色させる
③ ポリマー法（abcam社、HRP polymer）
酵素と二次抗体が標識されたポリマー試薬を使用する。標識酵素はペルオキシダーゼとアルカリフォスフォターゼ。
ポリマー法のしくみ
- 抗原に1次抗体を反応させる
- 1次抗体にポリマー試薬を反応させる
- ポリマー試薬に標識された酵素の活性を利用して発色基質を発色させる
抗原賦活化
抗原決定基がホルマリン固定によってマスクされて、抗体と結合できなくなることがある。そこで、抗原賦活化処理によってマスクされた抗原決定基を露出させ、抗体と結合できるようにする。
抗原賦活化処理には加熱処理、蛋白分解酵素処理、ギ酸処理がある。
加熱処理
方法：電子レンジを使う方法
- ビーカーなど耐熱容器に加熱溶液とスライドグラスを入れる。上にフワッとラップをかける。
- 別の耐熱容器に加熱溶液と同量の蒸留水を加える。
- 家庭用電子レンジでスライドグラス入り耐熱容器と蒸留水入り耐熱容器を10分加熱。
- 加熱溶液が減ってスライドグラスが水面からはみ出る場合、同時に加熱した蒸留水で減った分量を補う。
- さらに５分加熱
- 常温に放置して冷ます。手で触れることができる程度に冷めたらスライドグラスを取り出して水洗する。
方法：オートクレーブを使う方法
- 蓋付き耐熱容器に加熱溶液とスライドグラスを入れる
- オートクレーブで120℃10分間加熱する
加熱溶液
- 0.01Mクエン酸緩衝液、pH6.0、pH7.0、pH8.0
- 1mM EDTA、pH8.0
※基本は0.01Mクエン酸緩衝液、pH6.0で加熱する
蛋白分解処理
- 0.04%プロテイナーゼK、室温10分
- 0.1%トリプシン、37℃、30分
ギ酸処理
- ギ酸原液を切片上にのせる、室温、５分間
※ Aβなどギ酸処理が必要な抗体がある
使用する試薬
① 洗浄液
- PBS
- PBST (PBS + 0.05%Tween20)
② 内因性ペルオキシダーゼ阻止液
- 3%過酸化水素水
③ 抗原賦活化液
- 抗原賦活化の項を参照
④ ブロッキング液
- 10%正常動物（※）血清 + 0.01%アジ化ナトリウム / PBST
※ 二次抗体と同じ動物種の血清を用いる。
⑤ 発色液（標識酵素がペルオキシダーゼの場合）
- ジアミノベンチジン(DAB) 5mg + PBS 10ml + 30%過酸化水素水 5μl
