① 固定

② 水洗

③ 切り出し

④ 番号付け

⑤ 脱水

⑥ 脱アルコール

⑦ パラフィン浸透

⑧ パラフィン包埋

⑨ 台木につける

⑩ 薄切

⑪ 脱パラフィン ＆ 浸水

⑫ 染色

⑬ 脱水・透徹・封入

⑫ 染色

ボディアン（Bodian）染色

プロテイン銀によって正常神経突起およびニューロフィラメントなど細胞骨格の凝集体（神経原線維変化など）を赤紫色に染める。染色手技は簡単で、しかも安定した染色結果を得ることができる。

染色手順

注意：鍍銀・鍍金の行程では、金属製品の使用は避け、プラスチックおよびガラス製品を用いる。

1脱パラフィンキシレン3槽、各10分
2脱キシレン100%エタノール3槽、各5分
3浸水95%、70%エタノール各5分
4流水洗水道水2分
5水洗 ※1蒸留水 
6鍍銀 ※2鍍銀液1晩、37℃
切片の色：薄茶
7水洗 ※3蒸留水3槽、各槽で5回ずつ切片をゆらす
手早く
8還元 ※3還元液10分
切片の色：黄土
9流水洗 ※4水道水数分
10水洗 ※5蒸留水 
11鍍金 ※5鍍金液1時間
切片の色：赤茶
12流水洗 ※6水道水10分
切片の色：紫
13還元 ※72%シュウ酸水溶液5分
切片の色：濃い紫
14流水洗 ※8水道水数分
15定着 ※9定着液10分
切片の色：赤茶紫
16流水洗 ※10水道水10分以上
17脱水70%、95%エタノール各5分
18脱水100%エタノール3槽、各5分
19透徹キシレン3槽、各10分
20封入  

作業ポイント

ここでは大型切片を用いた作業手順を説明しています。
大型切片を染色するためにシャーレを利用しますが、標準サイズの切片は染色バットを利用して染色します。

※1 水洗

作業
  • 蒸留水
  • ３回
  • ここからプラスチック製ピンセットを使う

※2 鍍銀

作業色変化

鍍銀液：0.5%プロテイン銀水溶液

  • 一晩、37℃
  • 銅片を蒸留水で洗い、静かにプロテイン銀水溶液に沈める。
 ※銅片は端に置く。 ※小さい切片を染色バットに入れる場合は、銅片を底に置く。 鍍銀液に一晩浸けた後
（うすい茶色）

※3 水洗、還元

作業色変化

水洗

蒸留水洗

蒸留水１〜３槽

  • 各槽で５回程度ずつ切片をゆらす。
    手早く

還元

還元液：ヒドロキノン・無水硫酸ナトリウム液

  • 10分
 還元液に入れる前
（うすい茶色）
還元液に入れた後
（黄土色）

※4 流水洗

作業

水道水

  • 数分

※5 水洗、鍍金

作業色変化

水洗

蒸留水

蒸留水１〜３槽

  • 各槽で５〜10回切片をゆらす

鍍金

鍍金液：1%塩化金水溶液

  • １時間
 塩化金に入れた直後。白っぽい 30分経過。時間の経過に伴い色が濃くなる。 １時間経過。茶紫

※6 流水洗

作業

水道水

  • 10分
  • 流水洗の長さで染め上がりの色合いが異なってくるので注意が必要。10分以上水洗すると色合いは落ち着く。

※7 還元

作業色変化

2%シュウ酸水溶液

  • ５分
  • ここから金属製器具を使ってもよい
 2%シュウ酸に入れる前 入れた後（濃い紫）

※8 流水洗

作業

水道水

  • 数分

※9 定着

作業色変化

定着液：写真の定着液（10倍希釈）もしくは5%チオ硫酸ナトリウム水溶液

  • 10分
  • 定着液に入れる時間の長さによって色合いは異なる。長いほどコントラストがはっきりする。
 定着液に入れる前 入れた後（赤茶紫）

※10 流水洗

作業

水道水

  • 10分以上
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染色結果

内包の軸索（200倍)

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試薬

  1. 0.5%プロテイン銀水溶液
  2. ヒドロキノン・無水硫酸ナトリウム液
  3. 1%塩化金水溶液
  4. 2%シュウ酸水溶液
  5. 写真の定着液（10倍希釈）もしくは5%チオ硫酸ナトリウム水溶液

試薬の調整

0.5%プロテイン銀水溶液

プロテイン銀0.5g
蒸留水100ml
銅片5g
  • プロテイン銀は蒸留水の上に振りかけて、自然に溶解するのを待つ
  • 泡立つので撹拌はしない
（写真はプロテイン銀S使用）
  • 細かなカスが浮いている場合は濾過する
  • 泡立つので静かにそそぐ
  • 泡立ったらピンセットなどで隅によせる
（写真はプロテイン銀S使用）
  • 銅片を蒸留水で洗う。
  • プロテイン銀液に切片を入れる際に、銅片も静かに液中に沈める。
（写真はAlbumosesilber使用）

0.5%プロテイン銀水溶液調整上の注意点

プロテイン銀S


内包の軸索（200倍）、プロテイン銀S使用
 Albumosesilber


内包の軸索（200倍）、Albumosesilber使用

ヒドロキノン・無水硫酸ナトリウム液

蒸留水にハイドロキノンを溶かしてから無水硫酸ナトリウムを加える。

ハイドロキノン1g
無水硫酸ナトリウム４g
蒸留水100ml

１％塩化金水溶液

繰り返し使用可能である。使用後濾過し、冷蔵保存する

塩化金１g
蒸留水100ml

常備すると便利な試薬

1%塩化金水溶液（冷蔵保存）
 2%シュウ酸水溶液
 定着液

プロテイン銀の種類

神経病理解析室で使用しているプロテイン銀。富士フィルム和光純薬のプロテイン銀以外は販売中止のため入手できない。下記以外で入手可能なプロテイン銀は市場にあるが、メーカーによって全く染まらないものがあるので注意が必要。

製品名製造会社入手状況
プロテイン銀 ※注意富士フイルム和光純薬（株）販売中
AlbumosesilberMERCK販売中止
Albumosesilber DAB6MERCK販売中止
プロテイン銀S第１化学薬品(株)販売中止

※ 注意

富士フイルム和光のプロテイン銀は私達と染色方法が異なる部分がある。プロテイン銀を使用する際は、富士フイルム和光のwebsiteを参照すること。

銅の種類

ボディアンに使用する銅は銅片だけではなく様々な形状のものがある。使いやすいものを選ぶ。
我々は関東化学の銅（片状）を用いている。

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染色態度

神経細胞

正常細胞・組織 異常構造・生理的変性構造 見えないもの
細胞質が淡く染まる 嗜銀性増強：
NFT、ピック球（縁が明瞭）
MSAの神経細胞内封入体（橋核）

神経突起

正常細胞・組織異常構造・生理的変性構造 見えないもの
茶褐色
  • 種々の軸索腫大（濃淡はまちまち）
  • 樹状突起変化（カクタス、アステロイド小体）
  • グルモース変性の“もやもや”＆終末ボタン
  • 老人斑の変性軸索（アミロイドも染まる）
  • 糸球体構造（オリーブ仮性肥大）
 レビー関連ニューライト
ニューロピルスレッド
グレイン

アストロサイト

正常細胞・組織異常構造・生理的変性構造見えないもの
染まらない 染まらない 房様アストロサイト、アストロサイト斑

オリゴデンドログリア

正常細胞・組織異常構造・生理的変性構造見えないもの
染まらない
  • グリア細胞質内封入体（淡い）
  • グリアコイル小体（染まる場合もある）
 嗜銀性スレッド

動画でまなぶ染色態度

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