⑫ 染色

ニッスル(Nissl)染色

核およびニッスル小体(粗面小胞体)をクレシルバイオレットで青紫色に染める。

クリューバー・バレラ染色(KB染色)に用いられる。

染色手順

1脱パラフィンキシレン3槽、各10分
2脱キシレン100%エタノール3槽、各5分
3浸水5%、70%エタノール各5分
4流水洗水道水 
5水洗蒸留水 
6染色0.1%クレシルバイオレット水溶液10分、37℃
7分別95%エタノール+10%酢酸数滴5〜10分程度
次の行程でも分別されるため分別しすぎない
8分別95%、100%エタノール1分程度づつ
核とニッスル小体のみが青紫色になるまで分別する
9検鏡 分別は顕微鏡下で確認しながら行う
分別が不足なら⑦、⑧をやり直す
10脱水100%エタノール2槽、各5分
11透徹キシレン3槽、各10分
12封入  

0.1%クレシルバイオレット水溶液(濾過して使用)

クレシルバイオレット1g
蒸留水1000ml

クレシルバイオレットのpH値

染色液のpHの値によって染まり方が異なる。pHの値が3.0近辺では、ニッスル小体、核小体、核膜のみが淡青色に染まる。グリア細胞の核はうっすら染まる程度である。pHの値が高くなるにつれて全体的に色が濃くなり、神経細胞の細胞形質、神経線維、グリア細胞などが共染するようになる。pH4.0近辺では共染が強くなるため、分別にかかる時間が長くなる。

クレシルバイオレットの種類

現在、神経病理解析室で使用しているクレシルバイオレットは以下の3つ。

製品名製造会社入手状況
Cresyl Violet AcetateEM SCIENCE販売中止
Cresyl Violet acetateSIGMA入手可
Cresyl violet (Acetate)MERCK入手可

クレシルバイオレットの製品による分別時間の違い

製品によって染色液のpHが異なるため染まり方が異なる。したがって、分別にかかる時間がそれぞれの製品によって異なるため注意が必要。しかし、どの製品を使用しても、鏡検しながら分別をすることで最終的に得られる染色像を同じにすることができる。

製品名製造会社0.1%水溶液のpH95%エタノール分別にかかる時間
Cresyl Violet AcetateEM SCIENCE3.510〜30秒
Cresyl Violet acetateSIGMA4.710分ぐらい
Cresyl violet (Acetate)MERCK4.810分ぐらい

※ SIGMA社とMERCK社の染色液に10%酢酸を適量加え、pHを3.5から3.8程度に調整することによって、95%エタノール分別にかかる時間を短くすることが可能。しかし、酢酸を加えた染色液は再利用しない。

分別のポイント

背景が白くなるまで分別する。また神経細胞の核は、核小体および核膜が明瞭で染色質の色が薄く染まるのが理想。

SIGMA, Cresyl Violet acetate(pH4.7)使用

写真左)95%エタノール分別、10秒のみ:分別が不十分だと神経細胞全体がべったり青く染まっているため、核、ニッスル小体を識別できない。

写真右)95%エタノール分別、10分間:分別を十分に行うことにより、神経細胞の核、ニッスル小体がはっきりと区別できるようになる。