私どもは 株式会社高島商店 T-19-TN-1 パラフィン包埋装置を使用しております。

私どものプロトコールには決まった煮沸時間はなく、 アニリンブルーの粉が溶けるまでとしております。 （溶ける時間は粉の量に依存します）
アニリンブルーの粉のだまだましたものがなくなるまで煮沸します。
溶けると透き通った黒い色になります。
濾過する際に溶けたかどうか確認できると思います。

染色性が安定しない理由は染色手技とは限りません。
染色の前の固定、脱水、包埋、薄切、脱パラフィンなどのプロセスに問題がある場合があります。
特に固定の良し悪しは染色性を大きく左右します。
どのような状況で標本作製されているのか詳細は分かりませんが染色に至るまでの手技を一度見直すと意外と良い結果がでるかもしれません。

脳全体をそのまま固定液に入れて固定する浸漬固定が主流です。 脳を取り出した後、10%中性緩衝ホルマリン液に入れて10日間から2週間固定しております。

クレシルバイオレットは溶けづらいので私は以下のように調整しています。 1000ミリリットルの蒸留水に1ｇのクレシルバイオレットを入れて温めながらしばらく撹拌します。 帰宅前に60度恒温槽に入れて一晩放置し、 翌日しばらく撹拌した後に濾過します。
一般的な染色の教科書にはクレシルバイオレット液に酢酸を添加する調整方法が 紹介されていると思います。私はクレシルバイオレット液には酢酸を添加しません。

クレシルバイオレット液のpH値によって染まり方が異なリます。
pH値が3.0近辺では、ニッスル小体、核小体、核膜のみが淡青色に染まります。
pHの値が高くなるにつれて全体的に色が濃くなり、 神経細胞の細胞形質、神経線維、グリア細胞などが共染するようになります。
もしかしたら、染色液のpH値が低いため染まりが悪いのかもしれません。
一度染色液のpHを確認しても良いかと思います。

抗原性賦活化について蟻酸処理を試したとのことですが、 私はこの抗体を使用する際に蟻酸処理を行ったことはありません。 pH6.0の0.01Mクエン酸バッファーでオートクレーブ121度10分間行っております。
オートクレーブではなく、電子レンジで15分間加熱でも良いと思います。
電子レンジ使用の際は突沸に十分ご注意ください。
必ずシグナルが得られると分かっているポジティブコントロールであっても染色がうまくいかないようでしたら、染色条件以外に問題があると思います。
また、pTDP43ではない他のタンパク質が凝集している可能性を考慮し、pTDP43だけではなく、ユビキチン抗体で染色をしても良いのではないかと思います。

私どものプロトコールではガリアス染色の非特異的反応を小さくするために過マンガン酸カリウム処理を行っていますが、それでも軟膜や赤血球などは染まってしまいます。観察する際にHE染色標本と見比べながら観察をするか、出血部位を出来るだけ避けて標本を作製するか、などで対応をします。

神経病理解析室では媒染処理はしないで染色しています。

膠原線維の染色法はGomori’s one step trichrome以外にも色々あって、媒染が必要となる染色法もあります。Gomori’s one step trichromeは媒染がないため手間のかからない染色法として 神経病理解析室に伝わっています。

比較的短時間で染色できるので気軽な染色法なのではないかと思います。

私達は75✕105mmと76✕52mmのスライドグラスを染色する際に、大型の染色かごと染色瓶を活用しております。染色かごと瓶は共に特注品です。

染色カゴ（染色カゴは取手が取り外せるようになっております）
カゴ：36✕78mm高さ35mm
取手：高さ80mm、持ち手部分75mm

染色瓶：内径90✕50mm, 高さ130mm, 厚み3.8mm
染色瓶の蓋：105✕65mm, 厚み3.8mm

HEや銀染色、βAPP染色は外傷以外の要因による軸索障害も検出します。外傷特異的に軸索障害を検出する染色法はありません。

軸索腫大の検出には、GB染色よりボディアン染色の方が適しております。ただし、ボディアン染色は正常な軸索も染めますので軸索腫大の検出は慣れていないと分かりづらいと思います。βAPP陽性となった部位をよく見ていただければと思います。

SMI31染色は基本的にはボディアン染色と同様の染色像が得られます。ボディアン染色は軸索のほかに細胞成分や血管なども視覚化しますので、SMI染色の方が見やすいと思います。

組織の割れが固定前と固定後のどちらで生じているのか見極める必要があります。

• 固定前に機械的な圧力などで組織が損傷を受けると、好酸性になったり、細胞成分が変形することがあります。HE染色標本で、割れた部位と周囲の組織の色合いや細胞成分の形態が極端に異なるか確認しましょう。
• 脱水時に組織が収縮する際に、組織が割れる可能性もあります。脱水の条件を見直してみましょう。

シワが入る時の応急措置として、

1. お湯の温度を変える
2. 切片をお湯で伸ばす時間を変える
3. 薄切するときにブロックを冷やす

など試してみても良いかもしれません。

メセナミン銀液は１時間したら様子を見て1時間15分から30分程度で引き上げても良いと思います。途中顕微鏡で染色性をチェックしながら良い時間を決めてみてください。

塩化金は濃度を濃くして短くすれば良いのではないでしょうか。1％にして30分から1時間程度でも良いと思います。塩化金は背景処理をするための行程です。背景がきれいなら短めに強いようなら長めに調整してみてください。

白く濁ったものは銀が析出しておりますので使用せず廃液として処理してください。

A液をピペッターで少量ずつ混ぜると良いと思います。

ガリアス染色では非特異的反応を小さくするために切片を酸化剤で酸化する行程があります。過ヨウ素酸水溶液、硝酸ランタン水溶液、過マンガン酸カリウム水溶液が酸化剤として用いられてきております。 私はその中でも劇的に非特異的反応を抑えることができる過マンガン酸カリウム水溶液を使用しております。 この場合、硝酸ランタンは作用がかぶるため使用する必要はありません。

筋肉の標本を取り扱った経験がないので筋肉疾患の専門医におつなぎいたします。

anti-Glial Fibrillary Acidic Protein mouse monoclonal, GF 12.24, lyophilized, purified を使用しております。

Anti-Alzheimer Precursor Protein A4, clone 22c11 を使用しております。