⑫ 染色

メセナミン銀染色(メセナミン銀を用いた神経原繊維の染色)

メセナミン銀染色は老人斑やアルツハイマー神経原線維変化を検出する染色法である。また、ボディアン染色では染まりにくいびまん性老人斑の検出に優れている。

メセナミン銀を用いた神経原繊維染色は老人斑や神経原繊維の染色を目的としている。

メセナミン銀染色 ボディアン染色 ガリアス染色

染色手順

注意:鍍銀・還元・鍍金の工程では、金属製品の使用は避け、プラスチックおよびガラス製品を用いる。

1脱パラフィンキシレン3槽、各10分
2脱キシレン100%エタノール3槽、各5分
3浸水95%、70%エタノール各5分
4流水洗水道水 
5水洗 ※1蒸留水3回
6媒染 ※1前処理液4時間〜1晩
7水洗 ※2蒸留水3回
8還元 ※220%ホルマリン10分
9流水洗 ※3水道水 
10水洗 ※4蒸留水3回
11鍍銀 ※4メセナミン銀液60℃ 1時間程度
12水洗 ※5蒸留水3回
13鍍金 ※51%塩化金1時間
14流水洗 ※6水道水15分
15還元 ※72%シュウ酸水溶液5分
16流水洗 ※8水道水5分
17定着 ※9定着液10分
18流水洗 ※10水道水10分以上
19脱水75%、95%エタノール各5分
20脱水100%エタノール3槽、各5分
21透徹キシレン3槽、各10分
22封入  
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作業ポイント

※1 [水洗、媒染]

作業色変化
水洗

蒸留水

  • 1分×3回
  • ここからプラスチック製ピンセットを使う
媒染

前処理液

  • 4時間〜1晩
    (1晩おくと切片が少し黄色っぽくなる)
前処理前 前処理後
少し黄色っぽくなる

※2[水洗、還元]

作業色変化
水洗

蒸留水洗

  • 蒸留水1〜3槽
  • 各槽で5回程度ずつ切片を揺らす
  • 硝酸銀が落ちるためあまり長くはおかない
還元

還元液:20%ホルマリン溶液
(色が少し濃くなる)

還元前 還元後
色が濃くなる

※3[流水洗]

作業

水道水 数分

※4[水洗、鍍銀]

作業色変化
水洗

蒸留水洗

  • 蒸留水1〜3槽
  • 各槽で5〜10回切片をゆらす
鍍銀

鍍銀液:メセナミン銀液

  • 1時間
  • メセナミン銀液に切片を入れて60℃の恒温槽内で1時間くらい反応させる
反応前 反応後(褐色)
  • 加温は使用機器やメセナミン銀液量、試料の状態など様々な要因で反応時間が異なる
  • 目安として組織の色が褐色を呈するまで行う
  • 組織によって反応時間が変わる。反応が悪い場合はさらに時間をおく

※5[水洗、鍍金]

作業色変化
水洗

蒸留水洗

  • 蒸留水1〜3槽
  • 各槽で5〜10回切片をゆらす
鍍金

鍍金液:1%塩化金水溶液

  • 1時間
反応前 1時間後(黒灰色)

※6[流水洗]

作業

水道水

  • 15分

※7[還元]

作業色変化

2%シュウ酸水溶液

  • 5分
  • ここから金属器具を使ってもよい
反応前 反応後(黒紫色)

※8[流水洗]

作業

水道水

  • 5分

※9[定着]

作業色変化

定着液:写真の定着液(10倍希釈)もしくは5%チオ硫酸ナトリウム水溶液

  • 10分
反応前 反応後(赤茶紫色)

※10[流水洗]

作業

水道水

  • 10分以上
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染色結果

老人斑と神経原線維変化


3%

5%

10%

メセナミン濃度の違いによる染色結果の違い


3%

5%

10%

スライドガラスによる染色結果の違い

コーティングによってはガラス全体に色がついてしまう。
我々はシランコーティングや卵白アルブミンコーティングを使用している。


プラチナプロコーティングガラスを使用

APSコーティングガラスを使用
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試薬

試薬の調整

前処理液

蒸留水50 ml
ホウ酸2.5 g
硝酸銀2.5 g
ピリジン5 ml

※ ピリジンは刺激臭があるので取り扱いの際はドラフト内で行う。

メセナミン銀液

5%メセナミン水溶液25ml
5 %硝酸銀水溶液2.5 ml
蒸留水12.5 ml
5 %ホウ砂水溶液2.5 ml
0.1%ゼラチン液(羽賀改良法より) 12.5 ml

作り置きすると便利な試薬

5%メセナミン銀液(冷蔵保存)
5%硝酸銀溶液(冷蔵保存)

※長期保存すると黒く変色してくるので注意する
0.1%ゼラチン液(冷蔵保存)
1%塩化金水溶液(冷蔵保存)
 
 
2%シュウ酸水溶液
 
 
定着液
フジフィックス(富士フイルム)
使用時10倍希釈

※ 1%塩化金水溶液、2%シュウ酸水溶液、定着液は長期保存が可能で他の銀染色にも使用できるため、常備すると便利である。